DH10Bac Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG/pMON14272 / pMON7124

簡(jiǎn)要說明：

DH10Bac感受態(tài)主要用于生產(chǎn)重組桿狀病毒分子（Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)）。DH10Bac菌株中含有父本桿粒bMON14272、輔助質(zhì)粒pMON7124：父本桿粒 bMON14272包含mini-F復(fù)制子,卡那抗性基因, attTn7位點(diǎn)和lacZα互補(bǔ)因子；輔助質(zhì)粒pMON7124含有tnsABCD區(qū)（tnsABCD region supplies thetransposition proteins required for insertion of themini-Tn7 from the donor plasmid into its target site onthe parent bacmid），具有四環(huán)素抗性，在細(xì)胞擴(kuò)增過程中丟失，但可提高供體質(zhì)粒pFastBac轉(zhuǎn)化后的基因轉(zhuǎn)座效率。mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA ,both prokaryotic and eukaryotic, can be clonedefficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15的存在使DH10Bac可用于藍(lán)白斑篩選，High5TM系列DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>108cfu/μg。

操作說明：

1.DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻，待菌體處于冰水混合狀態(tài)時(shí)迅速插入冰中），加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。 

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入900μl不含抗生素的SOC無菌培養(yǎng)液，混勻后37℃，225 rpm復(fù)蘇4小時(shí)。4.復(fù)蘇完成后，用S.O.C.稀釋轉(zhuǎn)化液到（10-1，10-2），每個(gè)稀釋用吸取100ul鋪一個(gè)LB平板（共涂3個(gè)平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱48h。

 陽性驗(yàn)證： 

1.挑10個(gè)白色的克隆，重新劃線在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度過夜培養(yǎng)。 

2.挑選白色的克隆，轉(zhuǎn)接到含有50ug/ml Kan，7ug/mlGentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。 

3.使用試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重組質(zhì)粒是否正確重組。

注意事項(xiàng)：

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。 

2.混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作。 

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。 

4. 涂板時(shí)務(wù)必涂干，平板表面不留任何水漬。